Производи

Разумевање метаболизма микробног домаћина је од суштинског значаја за развој и оптимизацију биокаталитичких процеса заснованих на целој ћелији, јер диктира ефикасност производње.Ово посебно важи за редокс биокатализу где се користе метаболички активне ћелије због регенеративног капацитета кофактора/косубстрата ендогеног у домаћину.Рекомбинантна Есцхерицхиа цоли је коришћена за прекомерну производњу пролин-4-хидроксилазе (П4Х), диоксигеназе која катализује хидроксилацију слободног Л-пролина у транс-4-хидрокси-Л-пролин са а-кетоглутаратом (а-КГ) као косубстратом.У овом биокатализатору целе ћелије, централни метаболизам угљеника обезбеђује потребан косубстрат а-КГ, спајајући биокаталитичке перформансе П4Х директно са метаболизмом угљеника и метаболичком активношћу.Применом и експерименталних и рачунарских биолошких алата, као што су метаболички инжењеринг и (13)Ц-метаболичка анализа флукса ((13)Ц-МФА), истражили смо и квантитативно описали физиолошки, метаболички и биоенергетски одговор биокатализатора целе ћелије до циљане биоконверзије и идентификована могућа метаболичка уска грла за даљи рационални инжењеринг путева. Е. цоли сој са недостатком деградације пролина је конструисан брисањем гена путА који кодира пролин дехидрогеназу.Биотрансформације целе ћелије са овим мутираним сојем довеле су не само до квантитативне хидроксилације пролина већ и до удвостручавања специфичне стопе формирања транс-4-Л-хидроксипролина (хип) у поређењу са дивљим типом.Анализа флукса угљеника кроз централни метаболизам мутантног соја открила је да повећана потражња за а-КГ за активношћу П4Х није појачала флукс који ствара а-КГ, што указује на строго регулисан рад ТЦА циклуса у проучаваним условима.У соју дивљег типа, синтеза и катализа П4Х изазвали су смањење приноса биомасе.Занимљиво је да је сој ΔпутА додатно компензовао повезани губитак АТП и НАДХ тако што је смањио потребе за енергијом за одржавање при упоредиво ниским стопама узимања глукозе, уместо да повећа активност ТЦА. бити обећавајући за продуктивну П4Х катализу не само у смислу приноса биотрансформације, већ и у погледу стопа биотрансформације и узимања пролина и приноса хип на извору енергије.Резултати показују да, након нокаута путА, спајање ТЦА-циклуса са хидроксилацијом пролина преко косубстрата а-КГ постаје кључни фактор ограничавања и циљ за даље побољшање ефикасности а-КГ-зависних биотрансформација.