Производи

Да бисмо специфично квантифицирали неколико метаболита 5-флуороурацила (5-ФУ) и два ендогена монофосфатна нуклеотида, развили смо оригиналну методу засновану на течној хроматографији-тандем масеној спектрометрији (ЛЦ-МС/МС).Овај тест је омогућио одређивање: (и) интрацелуларне производње 5-флуоро-2′-деоксиуридин-5′-монофосфата (5-ФдУМП) из 5-ФУ или 5-флуоро-2′-деоксиуридина (5-ФдУрд) , (ии) утицај концентрације 5-ФдУМП на интрацелуларни однос 2′-деоксиуридин-5′-монофосфат (дУМП)/тимидин-5′-монофосфат (ТМП), и (иии) степен секреције 5-ФдУМП и 5-ФУ из хуманих ћелија култивисаних АБЦ транспортерима.У нашим експерименталним условима, ћелије су инкубиране са 5-ФУ или 5-ФУрд.Затим су ћелијски протеини преципитирани метанолом.Овај поступак је обезбедио висок опоравак екстракције.Поред тога, да бисмо измерили секрецију 5-ФУ и 5-ФдУМП из ћелија, извршили смо квантификацију ових молекула у медијуму културе.Медији су или директно убризгани (5-ФУ) или подвргнути екстракцији чврсте фазе коришћењем Оасис Вак кертриџа за екстракцију (5-ФдУМП).Одвајање аналита је извршено на дЦ18 Атлантис 3,5 μм, (100 мм × 2,1 мм ид) колони са изократским режимом коришћењем амонијум форматног пуфера/метанола/воде (5/5/90, в/в) као мобилне фазе.Време рада није прелазило 6,2 мин.Аналити су јонизовани у електроспреј интерфејсу у режиму негативних јона.Ми смо валидирали методу у опсегу од 2,5–150 нг мЛ -1 у складу са једињењима.Интра- и интер-тест варијабилност је била нижа од 10% током седам дана.Сва једињења су била стабилна у ћелијама или у медијуму културе када су узорци чувани на -20 °Ц најмање две недеље и након три циклуса замрзавања-одмрзавања.У оба медија није примећен матрични ефекат.